慢病毒载体悬浮培养工艺开发新策略：平行式生物反应器与DOE强强联合
创新疗法将成为
新一代重疾疗法的重要一环
细胞与基因疗法用于满足当前小分子和生物治疗方法无法实现的临床需求。腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒等病毒载体是遗传物质的有效递送系统，可用于细胞与基因治疗和疫苗生产。慢病毒可用于新型细胞免疫疗法（基因修饰细胞疗法），如CAR-T细胞疗法的遗传信息传递。这些创新方法将成为新一代重疾疗法的重要一环。
贴壁工艺向悬浮培养
转变成为CGT重大挑战
临床候选药物的数量正在迅速增加，商业化生产成为现实。病毒载体的生产工艺需要高水平的操作专业知识和应用GMP指导原则，然而，目前这些工艺仅基于已有的研发方法开发。当前主要有两种生产病毒载体的策略。HEK293T细胞通常用作慢病毒载体（LVV）生产的主力细胞系，用于细胞和基因治疗。这些细胞的贴壁生产工艺使用静态培养瓶，如T培养瓶、细胞工厂或细胞堆栈。这些贴壁培养工艺开发和操作比较简单，但缺乏自动化和放大能力。
使用摇摆式或搅拌罐式生物反应器则容易实现自动化和放大。因此，为了以商业规模生产病毒载体，2D贴壁工艺方法必须转向3D悬浮培养，这成为细胞和基因治疗行业的重大挑战。
可以使用悬浮适应细胞系实现从贴壁2D培养到3D培养的转变。微型生物反应器系统可以在10–15 mL小体积中平行筛选许多工艺参数，帮助促进工艺转变并实现快速工艺优化。
强强联合
赛多利斯整体解决方案
Ambr® 15是一种自动化微型生物反应器系统，能够实现与更大规模生物反应器相似的工艺控制（pH、DO、温度和搅拌速度）。
该系统体积较小且易于设置，降低了试剂、时间和劳动力成本。可以通过节省成本的方式筛选工艺参数，这对于CDMO和初创公司非常重要。系统提供的并行处理、自动化和良好的一致性可实现快速、高通量的工艺优化，包括DOE研究。与整合后，还减少了数据分析所需的时间。
此外，工作体积为100–250 mL的生物反应器系统）能够为更大的搅拌式生物反应器系统提供缩小模型。凭借其平行性和自动化，Ambr® 250 Modular还有助于用更少的工作量加速上游工艺的开发。
Ambr® 15和Ambr® 250是高效的缩小模型系统。尽管需要对这些系统进行表征，并且可能需要建立新的缩小模型标准，但由于两种系统的高通量筛选能力，这种表征可以高效地进行。
Univessel® 2L SU（一次性使用）台式生物反应器以及Biostat® B控制单元是中试生产运行、稳健性研究和小规模DSP研究初始材料生产的理想工具。其还可用于放大策略的确认，将工艺转移到适于GMP生产的更大规模搅拌罐生物反应器（STR）。基于对kLa、PPV和混合时间的多项研究，赛多利斯对反应器系统进行了充分的表征和优化，以更好的支持工艺放大策略。
图1显示上述Ambr®生物反应器系统的能力。由于其放大性，因此是工艺开发的理想工具。
图1 用于生物治疗药物生产不同阶段的赛利多斯生物反应器产品组合。
实验研究简介
研究的目
在小型和台式搅拌生物反应器中建立悬浮适应的HEK293T细胞培养方法和CD19-CAR慢病毒生产方法，作为概念验证研究。
研究方法
慢病毒生产
慢病毒质量控制与分析
研究结果
优化生产慢病毒的培养条件
优化Ambr® 15慢病毒生产中的PEIpro®转染
将慢病毒生产工艺升级到
将慢病毒生产工艺放大至实验室规模生物反应器Univessel® SU 2L
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研究结论
Ambr®生物反应器系统
是工艺开发的理想工具
本研究表明，微型生物反应器结合能够系统地研究关键工艺参数，并在更短的时间内实现快速、高通量工艺优化。
不仅培养参数优化，转染过程优化也能显著提高慢病毒滴度。
研究结果将有助于制造商确定需要控制的工艺参数，用于建立稳健且可预测的慢病毒生产工艺。值得注意的是，细胞系的类型，尤其是质粒的质量对病毒产量有显著影响。本研究中，我们事先评估了细胞系和质粒的来源。
研究结果证明，从摇瓶到可扩展搅拌生物反应器系统的转变可以非常快地完成，产生优质的慢病毒滴度。
从摇瓶放大到Ambr® 15系统可以获得以下优势：
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该系统是可放大的，能够筛选多种条件，有助于进行DOE研究
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能够控制工艺参数，如pH值、DO和CO2
此外，有研究证明，Ambr® 250 Modular能够进行有效和简单的规模放大，也可用于快速优化工艺参数。Ambr® 15中获得的结果与Ambr® 250 Modular中获得的结果具有良好的相关性，并为进一步扩大至2 L培养系统提供了良好的基础。实验结果还为放大至 2000 L 的生产工艺提供了良好的基础。
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